细胞和基因治疗领域应用专栏（一）：CRISPR/Cas9 基因编辑
细胞和基因治疗（Cell and Gene Therapy，CGT）是一种创新的医疗方法，它利用细胞或基因工程技术来治疗或预防疾病。这种治疗方法与传统的药物治疗不同，它直接作用于疾病的根本原因，即细胞和基因层面。CGT 可以分为两个主要分支，即细胞治疗和基因治疗，如，
免疫细胞治疗，如 CAR-T 细胞疗法，通过改造 T 细胞使其能够识别并攻击特定的癌细胞。还有干细胞治疗，利用干细胞的自我更新和分化能力来修复或替换损伤的组织。其他体细胞治疗如，使用其他类型的体细胞进行治疗，如心肌细胞治疗心脏病等。
基因治疗，通常指基因治疗通过将遗传物质（DNA或RNA）直接或通过载体（如病毒载体）传递到患者的细胞中。如基因修正，使用如 CRISPR/Cas9 等基因编辑技术，直接在细胞内修复有缺陷的基因。基因沉默，即使用 RNA 干扰（RNAi）或小干扰 RNA（siRNA）等技术来抑制特定基因的表达。还有基因添加，即将正常基因添加到患者的细胞中，以补偿缺陷基因的功能。
细胞和基因治疗的应用范围非常广泛，包括但不限于遗传性疾病、癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和传染病等。随着科学技术的进步，CGT 正在快速发展，为许多传统治疗方法难以治愈的疾病提供了新的治疗选择，如治疗遗传性疾病，治疗恶性肿瘤，多种慢性疾病的长期治疗，潜在能够解决某些传统药物无法治疗的疾病。综上所述，细胞和基因治疗因其独特的治疗机制和广泛的应用前景，在现代医疗领域中扮演着越来越重要的角色。
细胞基因治疗分类。
除此之外，抗体在细胞和基因治疗中发挥着多种关键作用，在细胞治疗方面，抗体可以用于细胞的筛选和分离。例如，通过与特定细胞表面标志物结合，从复杂的细胞混合物中分离出所需的免疫细胞，如用于 CAR-T 细胞治疗的 T 细胞。抗体还能用于引导细胞到达特定的组织或病灶部位。比如，将抗体与细胞治疗载体结合，使其能够特异性地靶向肿瘤组织，提高治疗效果。
在基因治疗方面，抗体可以作为载体的靶向部分。通过将抗体与基因载体（如病毒载体）连接，使基因能够精准地递送到特定细胞或组织中。例如，针对肿瘤细胞表面高表达的抗原设计抗体，连接到基因载体上，实现对肿瘤细胞的特异性基因递送。
抗体也可用于监测基因治疗的效果。通过检测治疗后相关抗体水平的变化，评估基因治疗对免疫系统的影响和治疗效果。
以治疗某些血液系统恶性肿瘤为例，利用抗体将携带治疗基因的载体特异性地递送到肿瘤细胞，能够更有效地发挥基因治疗的作用，同时减少对正常细胞的副作用。
本专栏分成基因治疗，细胞治疗，疫苗抗体三部分，通过具体实验示例，给大家展示如何应用 Molecular Devices 多种设备。
01
超过 3000 个人类基因与癌症和遗传疾病密切相关。阐明基因突变和人类疾病正变得越来越紧迫。CRISPR/Cas 基因编辑是基于基因的药物发现的一个组成部分，用于发现靶基因并进行基因敲除，从而深入了解由此产生的表型。从这个角度来看，这项技术是将患者基因组与表型相关联并增强精准医疗能力的一个巨大里程碑。
CRISPR-Cas9 应用更接近临床应用。重点是需要精确和高效的基因编辑技术。为了支持这些科学进步，Molecular Devices 的 ImageXpress 高内涵成像系统通过详细观察细胞内的这些递送机制来提供关键的见解，通过成像方式可以动态监控 CRISPR 递送过程。
SpectraMax 酶标仪和 FLIPR Penta 系统等工具的集成增强了我们对细胞生长、维持和功能的理解，在CRISPR 蛋白上标记荧光，通过酶标仪可以测定 CRISPR 编辑效率与递送效率。
CellXpress.ai 体外模型智能化工厂等解决方案支持细胞培养过程的自动化，有助于在科学研究中实现更可靠和可重复的结果。
实验流程。
具体实验条件：
01
细胞转染
将 HEK293 细胞接种于 6 孔板后，转染含有 Cas9 酶和靶向 ATG5 的 gRNA（5' AAGATGTGCTTCGAGATGTG 3'）的序列，同时细胞内转染 pCas-Guide-EF1a-GFP 质粒。当细胞内质粒表达后，可以通过测定 GFP 计算转染效率，SpectraMax i3x 酶标仪，识别绿色荧光通道并计算表达 GFP 的转染细胞个数，使用 StainFree 计算总细胞数，并通过将 GFP 阳性细胞数除以总细胞数，使用 SoftMax Pro 软件计算转染效率。
酶标仪检测转染效率。
02
DNA 和蛋白质纯化与定量
CRISPR 编辑过的细胞和未编辑过的细胞被裂解后，收集基因组 DNA 和总蛋白质。随后，使用 SpectraMax i3x 酶标仪分别使用紫外（UV）吸收定量和 BCA 蛋白质分析来测定 DNA 浓度和蛋白质浓度。
03
CRISPR/Cas9 基因编辑验证
进行聚合酶链反应（PCR）以确认质粒相关序列是否插入到正确的基因组区域（未显示）。从编辑过和未编辑过的细胞中分别加入蛋白质梯度 marker、5 微克和 10 微克总蛋白质到 4-20% 的 TGX 凝胶中，然后进行 SDS-PAGE。将蛋白质转移到 PVDF 膜上，并分为 3 个部分：Scan-Later 标样、加载对照和 ATG5 区域。标样使用 1:10000 的 Europium（Eu）-Streptavidin 处理。加载对照使用 1:10000 的兔抗-Vinculin 初级抗体孵育，而 ATG5 区域使用 1:2500 的兔抗-ATG5 初级抗体孵育。孵育后膜洗涤三次。然后对照和 ATG5 区域使用 1:10000 的羊抗-兔Eu 结合二级抗体孵育。再次洗涤三次后重新组装。使用 SpectraMax i3x 读数器和 ScanLater Western Blot 检测系统扫描 western blot 膜。扫描分析定量 western blot 图像，计算相对 ATG5 蛋白表达。
酶标仪ScanLater Western Blot检测蛋白条带。
04
自噬体定量
编辑过和未编辑过的细胞被分别培养在一个 96 孔细胞培养板中，并随后用 chloroquine 浓度梯度处理细胞 18 小时。之后，自噬体被染色使用 Enzo’s CYTO-ID® 自噬试剂盒检测，细胞核用 Hoechst 染色。图像通过 ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像系统上的 40 倍 PA（0.95NA）物镜在 FITC 和 DAPI 通道成像。利用 MetaXpress 软件和颗粒度预设模块来检测来量化每个细胞中的自噬体数量。数据被导出到 SoftMax Pro 软件生成图表。
高内涵对自噬体的成像与定量。
05
生物药物生产杂质检测
在生物药物生产过程中，可能会引入被称为生物药物工艺杂质的外来物，主要包括微生物污染、热原、细胞成份、培养基中的成份等，各种杂质的数量会影响最终药品的安全性，在生产过程中对杂质进行检测是非常重要的。以下是常见检测实验：
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宿主 DNA/蛋白残留定量：吸光度检测，绝大多数单、多功能酶标仪均可实现
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菌液浓度：吸光度检测，绝大多数单、多功能酶标仪均可实现
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支原体检测：化学发光检测，推荐 SpectraMax iD3/iD5/i3x/Paradigm
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内毒素检测：吸光度检测，可兼容鲎试剂动态显色法、动态浊度法、重组 C 因子法等多种路线。鲎试剂相关实验推荐 SpectraMax Abs/Abs Plus，重组 C 因子法实验推荐 SpectraMax M 系列 /iD3/iD5/i3x/Paradigm。
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如以上实例所示，MD 提供的多功能系统适用于基因治疗实验流程中多种实验和检测，其自动化和定量化的特点，可以帮助基因治疗方向的实验人员高效科学地完成实验。
结 语
关于美谷分子仪器
Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷，并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海设立了中国代表处，2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团，2011 年正式成立商务公司：美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内，我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。
